耐盐菌株在环氧废水中的降解特性

环氧树脂生产废水中含有大量的NaCl，极大地干扰了生化处理，处理难度和成本都很高。这是一种典型的高盐难降解工业废水。目前，这类高盐废水的处理方法主要有物理化学法、生物法和物化-生化组合法。自然界中的耐盐细菌生活在盐湖、盐碱湖和海水中，对盐度的耐受性可达20%。这些耐盐细菌的存在为高盐废水的生物处理提供了可能。近年来，耐盐细菌被应用于高盐废水如榨菜废水、高盐皂化废水的处理，耐盐细菌的筛选成为生化处理的关键步骤。本研究从废水生化处理系统的活性污泥中分离筛选耐盐细菌，并对其进行分子生物学鉴定和生长特性研究，以探讨耐盐细菌在环氧树脂废水中的降解特性，从而为此类含盐树脂废水的处理提供技术支持。

1.材料和方法

1.1实验材料

实验用水取自上海某化工厂生产环氧树脂的混合废水，经Fenton氧化预处理后稀释，并添加适当的营养物质。水质见表1。

细菌来源:上海某化工厂和某镇污水处理厂生化处理系统的活性污泥。

无机盐介质:硫酸镁& # 8226；7H2O0.2g克/升，KH2PO40.5g克/升，NH4Cl0.5g克/升，K2HPO41.5g克/升，NaCl(5 ~ 200克/升，根据需要调整)，微量元素溶液1毫升。微量元素:CoCl22g/L，NiCl & # 822626H2O0.05g/L，ZnCl20.05g/L，CuCl20.03g/L，FeCl & # 82263H2O 2g/L，MnCl20.5g/L，EDTA1g/L，pH 7.0。

斜面培养基:蛋白胨10g，牛肉酱5g，NaCl5g，KH2PO42g，NH4Cl1g，蒸馏水1000mL，琼脂20g，pH 7.0。

1.2实验方法

1.2.1耐盐菌株的筛选

通过逐渐增加NaCl浓度来筛选和培养耐盐细菌。从上述两种污泥中各取2.5g，加入装有100mL无菌水的已灭菌的250mL三角瓶中，加入无菌水质量0.01%的焦磷酸钠，摇床破碎微生物群。用无菌移液管吸取上述泥水混合物，在37℃、150r/min的恒温摇床中培养72小时，然后转移到5% NaCl质量分数为10%的无机盐培养基中(每代3组平行实验，传至第10代)进行驯化，直到无机盐培养基中NaCl质量分数达到15%，驯化完成。将驯化后的菌株接种到含有环氧树脂生产废水(COD1000mg/L)的无机盐培养基中，37℃摇床培养72h，得到目标菌株。放映结束了。

分离出的单菌落用涂布琼脂平板分离，然后将琼脂平板倒置于37℃恒温培养箱中72h。琼脂平板上的菌种长成菌落后，接种保存在斜面培养基上进行增菌，保存在4℃冰箱中备用。

经典分类学和16SrDNA序列分析用于确定菌株的分类和属。对选取的活化菌株进行测序，并在Genebank数据库中进行BLAST比对，得到较为接近的典型菌株的16SrDNA基因序列。用ClustalX1.8软件对与数据库中高度相似的典型菌株进行序列比对，用MEGA6.1软件构建系统进化树。

1.2.2菌株生长曲线

2菌株生长曲线无机盐培养基的盐度梯度(质量分数)用NaCl调至2%、4%、6%、10%，pH用NaOH溶液精确调至7.0。将富集的菌株在液体无机盐培养基中培养过夜，然后将10mL菌悬液接种到100mL含不同浓度NaCl的无机盐培养基中，在摇床中37℃恒温好氧培养。每2小时对菌液OD600取样。

上述培养基和药物在121℃灭菌30分钟备用。

1.2.3耐盐复合菌剂量比的确定

通过对上述耐盐细菌的筛选，得到耐盐细菌X1、X2、X3，每个菌悬液的OD600保持在1.2左右，规定每1mL菌悬液为1份。根据正交试验表，将菌悬液按所需比例组合，在50mL废水中加入5mL复合菌悬液，在生物摇床中37℃培养24h。测定了水中的COD，考察了各种组合比例的废水处理效果，确定了较好的比例。

1.2.4添加耐盐复合菌的生物处理

Fenton氧化预处理后，将环氧生产混合废水调节至合适的盐度，并补充合适的营养物质。将50mL处理后的废水加入250mL三角瓶中，根据实验设计条件加入耐盐复合菌悬液，考察废水中COD的去除情况。

1.3分析方法

OD600用UV-4802H紫外分光光度计测定，CODCr用HZ-HJ-SZ-0108测定，氨氮用HJ 535-2009测定，pH用pHS3C酸度计(上海雷磁仪器厂)测定。

2.结果和讨论

2.1耐盐菌株的筛选

经过对两种混合活性污泥的驯化、筛选、富集培养、分离纯化，筛选出三株耐盐细菌，分别命名为X1、X2和X3。与GenBankBlast软件的序列同源性比较显示，三个菌株均表现出较高的同源性，基于16SrDNA序列分析的进化树如图1所示。菌株X1被鉴定为产碱杆菌，菌株X2被鉴定为假单胞菌，菌株X3被鉴定为耐盐芽孢杆菌。

2.2耐盐菌株的生长曲线

分别以菌液OD600为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制了三个耐盐菌株的生长曲线，如图2所示。

从图2中可以看出，X1和X2可以在2%~10%的NaCl中生长，X3可以在2%~6%的NaCl中生长，但盐度对该菌株的生长速度影响很大。随着盐度的增加，菌株生长曲线的适应期变长，对数生长期的增长速度变慢。适应期较长的原因是微生物在不同盐度环境中接种后，需要一定时间的调整和适应，合成多种酶进一步完善体内酶系统后才会生长繁殖。而在高盐环境下，酶的合成速率下降，产生新的酶系统需要一定的时间。在对数生长期，微生物虽然处于营养过剩状态，但在对数生长期生长速度变慢。在高盐环境中，微生物需要花费大量的能量来调整自己的代谢途径，或者分泌胞外聚合物来抵抗外界的不良环境因素，同时也需要能量来合成自身生长所需的物质。因此，用于生长和繁殖的能量相对减少，自我生长率降低，世代时间延长。减速生长期延长可能是由于底物利用率降低，微生物存活率低，导致营养物质过剩。

2.3耐盐复合菌的生物处理

2.3.1耐盐复合菌剂量比的确定

研究表明，利用优势菌株(如耐盐细菌)降解有机污染物已成为一种有效的方法，微生物菌群处理有机物的效率高于单一菌株。因此，通过正交试验对分离的3株耐盐细菌确定了X1、X2和X3的组合比例，从而获得能够高效处理环氧树脂生产废水的复合耐盐细菌。正交试验结果如表2所示。

从表2可以看出，最佳水平组合为A2、B2和C3，因此三种耐盐细菌X1: X2: X3的最佳用量比为2: 2: 3(体积比)。

2.3.2耐盐组合菌对Fenton预处理废水的降解效果

实验固定了四个因子，调整了另一个因子，考察废水中COD的去除效果，如表3和图3所示。

(1)盐度。从图3(a)可以看出，当NaCl的质量分数为5%~8%时，组合耐盐菌对废水中有机物的降解效果在80%以上。当NaCl浓度为15%时，COD去除率急剧下降，这是因为随着盐度的增加，菌株的生长速度变慢，酶的合成受到限制，有机物的降解速度变慢。因此，组合微生物的最适NaCl浓度为5%~8%。

(2)反应时间。从图3(b)可以看出，生物摇床在37℃反应6h，废水中COD的去除率达到54%，12h后去除率约为70%，24h后去除率提高了3%。随着接触时间的延长，12～48h后COD去除率仍保持在80%以下。

(3)温度。在图3(c)中，废水的COD去除率随着温度的升高而逐渐增加，在37℃时达到约91%的较大值。当温度达到40℃时，COD去除率反而下降，主要是因为高温会抑制微生物的活性，从而降低废水的COD去除率。因此，耐盐细菌组合降解有机物的最适温度为37℃。

(4)pH值.图3(d)表明，当pH为7时，废水的COD去除率较为理想，达到85%左右；当pH值为5和6时，COD去除率分别为73%和65%左右；当pH为9时，COD去除率仅为30%左右。因此，耐盐组合菌对COD的去除效果在pH 7时较为理想，pH过低或过高都会影响微生物的活性，降低有机物的降解速率。

(5)细菌的用量。从图3(e)可以看出，废水中COD的去除率随着细菌投加量的增加而增加。细菌投加量为5%的废水COD去除率明显高于细菌投加量为3%的废水。当细菌投加量为5%和10%时，COD去除率分别为80%和94%。当细菌投加量为12%时，COD去除率为98%，但与10%相比降解率有限，因此细菌的最佳投加量为10%。

综上所述，在适合耐盐细菌生长的环境下，用其处理Fenton预处理后的废水，COD去除率可维持在70%~80%。通过单因素实验确定了最佳实验条件:pH值为7，反应时间为24h，反应温度为37℃，废水中NaCl浓度为5%~8%，耐盐复合菌的最佳投加量为废水体积的10%。

3.结论

(1)对环氧树脂生产废水处理系统和城镇污水处理生化池中的活性污泥进行驯化，筛选出3株耐盐细菌，命名为X1、X2和X3，它们能高效降解废水的COD，并能在高盐度环境中良好生长。采用16SrDNA序列分析方法进行鉴定，分离筛选出3株耐盐菌株，分别为X1产碱杆菌、X2假单胞菌和X3芽孢杆菌。

(2)通过正交试验，确定三株菌的最佳剂量比为2: 2: 3(体积比)。用该组合菌处理含盐量为5%~8%的Fenton废水时，耐盐组合菌的最佳投加量为废水体积的10%，摇床反应时间为24h，pH值为7，温度为37℃，能保持较高的COD去除率。(来源:中海油天津化工研究设计院有限公司)

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