废水污泥中邻苯二甲酸酯降解菌的多样性
随着增塑剂PAEs在日用品、建材、医药、化妆品等行业的广泛应用，其在环境中的残留、分布及其对生态系统的危害日益受到关注。据统计，世界上邻苯二甲酸酯的年消费量高达680万吨。由于PAEs和化合物的结合是物理的，所以很容易释放到环境中。这种释放过程可能发生在塑料产品的生产、使用和处置过程中。目前，PAEs存在于土壤、河水、海水、沉积物和生物群中，其在环境中的长期存在会对生物产生毒性作用。邻苯二甲酸酯广泛用于邻苯二甲酸二丁酯(DBP)和邻苯二甲酸二异辛酯(DEHP)。由于其致癌性、致畸性和致突变性，DBP和DEHP已被美国环境保护局列为优先污染物。
土壤、河水、海水甚至饮用水源中的PAEs污染与污水处理和排放密切相关。目前我国污水排放标准明确规定了常规生化指标和重金属含量，但PAEs等有机污染物不在其中。因此，即使污水达标排放，PAEs仍会随污水进入水环境系统，对周围土壤造成污染。
在我国，除了农业大棚和塑料薄膜的使用会直接造成PAEs对土壤的污染外，大部分含有PAEs的塑料制品废弃物都是通过垃圾堆放、填埋以及后期污水处理进入环境的。生活垃圾、医疗垃圾和工业垃圾长期堆放后，PAEs会从塑料制品中释放出来，并被雨水冲刷到垃圾渗滤液中。包括垃圾渗滤液在内的多种污水是PAEs的主要聚集地，只有在污水处理环节有效去除PAEs，才能避免PAEs对周围环境的二次污染。污水处理中的生物降解是去除各种有机污染物的关键因素。目前，关于污水处理系统中邻苯二甲酸酯降解菌的多样性以及邻苯二甲酸酯对污水处理系统中微生物群落结构的影响的报道较少。本研究系统探索了常规污水处理污泥对典型邻苯二甲酸酯的微生物群落响应特征以及污泥中邻苯二甲酸酯降解菌的多样性，为邻苯二甲酸酯降解菌的实际应用提供了理论依据。
一.材料和方法
1.1污泥取样
处理后的污泥取自浙江绍兴某污水处理厂好氧池，该厂长期处理化工和印染废水。新鲜污泥样品经沉淀、离心脱水后，4℃保存备用。
1.2主要培养基和试剂
盐培养基:1.00g/LKH2PO4，7.04g/lna 2 hpo 4 & # 8226；12H2O，0.10克/升gcl 2 & # 8226；6H2O，微量元素母液1mL，pH7.2。
微量元素母液:2.1385克/硫酸亚铁& # 8226；7H2O，0.1g/LZ NSO 4 & # 8226；7H2O，0.03克/lmn cl 2 & # 8226；4H2O，0.3g/LH3BO4，0.2868g/lcoc L2 & # 8226；6H2O，0.02克/升氯化锂& # 8226；6H2O，0.03g/lna 2 moo 4 & # 8226；2H2O，pH4.0 .
DBP和DEHP为色谱级试剂，其他试剂为分析纯试剂。
1.3 PAEs降解菌的富集培养
对DBP和DEHP分别进行增菌培养。各组实验设置如下:将5g废水处理污泥置于200mL碱性盐培养基中，加入100mg/LDBP或DEHP作为碳源，在30℃、200r/min的摇床中放置5天，然后转移到含400mg/LDBP或DEHP的碱性盐培养基中继续培养5天，然后连续转移两轮(DBP或DEHP的质量浓度梯度为700
1.4 DNA提取和序列扩增
用十六烷基三甲基溴化铵法提取样品的基因组DNA，琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度。将样品DNA稀释至1 ng/μ l，以稀释后的基因组DNA为模板，根据测序区域的选择，使用带条形码的特异性引物、带GC缓冲液的Phusion高保真PCR Master Mix和新英格兰BiGolabs公司的高效高保真酶进行PCR，保证扩增效率和准确性。PCR扩增引物序列和相应区域见表1。
1.5 Hiseq测序和数据处理
使用Thermofisher公司的ionplusfragmentlibrarykit 48 rxns试剂盒构建文库。量子位量化和文库检测后，在计算机上用IonS5TMXL对文库进行测序。用Cutadapt(V1.9.1)对测序数据进行部分切割，然后将条形码和引物序列切掉，初步得到原始数据。去除原始序列中的嵌合体序列后，得到最终的有效数据。
1.6数据分析
1.6.1可操作分类单元(OTUs)聚类和物种注释
使用Uparse软件(Uparsev7.0.1001/)对所有数据进行聚类，将具有97%或更高一致性的序列分类为一个OTUs。采用Mothur方法和SILVA的SSUrRNA数据库对OTUs的代表序列进行注释，获得分类信息，并在界、门、纲、目、科、属、种水平上统计群落组成。
1.6.2群体间群落相似性分析
根据测序数据和OTUs聚类分析结果，用Qiime软件计算Unifrac距离，用未加权组平均法进行样本聚类分析。利用R软件的ade4软件包和ggplot2软件包进行主成分分析，以反映群体间群落的相似性，并分别进行参数和非参数检验。选择Tukey和wilcox检验作为检验方法。
1.6.3植物区系丰度和系统发育多样性分析
首先用Qiime软件(1.9.1版)计算菌群多度指数和系统发育多样性指数。然后用R软件分析菌群多度和系统发育多样性，并分别进行参数和非参数检验。选择Tukey和wilcox检验作为检验方法。
二。结果和讨论
2.1 DBP和DEHP的降解效率
实验证明，经过四轮富集培养后得到的富集菌液对DBP和DEHP具有良好的降解效果。富集菌液对DBP和DEHP的降解效率见图1。当DBP和DEHP为1000mg/L时，培养第6天，DBP和DEHP的降解率分别达到57.1%和36.0%。培养10天后，富集菌液对DBP和DEHP的降解率分别达到99.9%和83.6%。DEHP的降解速率低于DBP，与文献一致，原因是DEHP比DBP含有更复杂的支链结构。
据介绍，DBP和DEHP的降解从酯水解开始，形成中间体单酯(邻苯二甲酸丁酯或邻苯二甲酸乙酯)和相应的醇，单酯进一步降解为邻苯二甲酸。由于两个酯链中的每一个都多了一个支链，增加了DEHP降解成单酯的难度，这是其降解速率比DBP慢的主要原因。
2.2污泥菌群丰富度及类群间群落相似性分析
分别取原污水处理污泥(简称RS群)和经DBP和DEHP降解菌富集培养后的污泥(简称DBP和DEHP群)进行Hiseq测序。OTUs聚类分析显示DBP、DEHP和RS组的OTUs数量明显低于RS组，DBP、DEHP和RS组的OTUs数量分别为226、273和848个。三个样本组的OTUs总数为205。DBP组和DEHP组的OTUs重叠率分别为90.7%和75.1%，而RS组仅有24.2%。结果进一步表明，DBP和DEHP的加入显著降低了富集培养过程中污水处理污泥中的微生物多样性。
本研究进一步开展了OTUs代表序列的物种注释和群落相似性分析。基于OTUs级别的PCA如图2所示。样本的群落组成越相似，它们在主成分分析中的距离就越近。DBP类群和DEHP类群的物种组成相似，但都与RS类群有较大差异。
2.3污泥中优势菌群和PAEs降解菌的分布
根据植物区系多度分析的结果，选择相对多度最高的10个优势种(见表2)，详细显示不同样品组的物种多度。变形菌和拟杆菌在所有样品组中都占优势，RS组的相对丰度低于DBP和DEHP组。在RS组中，放线菌的相对丰度也较高。Unifrac距离分析表明，DBP与DEHP类群的物种多度和优势类群相似，而DBP与DEHP类群和RS类群的相似性较低。
为了探索邻苯二甲酸酯降解菌在污泥中的分布，从DBP、DEHP和RS类群中的前35个属中筛选出具有DBP或DEHP降解能力的报道属。结果如表3所示。在DEHP群中，DEHP降解细菌被报道存在于戈登氏菌属、无色杆菌属、红球菌属、根瘤菌属和黄单胞菌属中；在DBP组中，DBP降解细菌被报道存在于优势属Delft、假单胞菌和鞘脂中。戈登氏菌属、红球菌属和根瘤菌属中也有DBP降解菌的报道，这表明许多具有DEHP降解能力的微生物菌株可能同时具有DBP降解能力，而另一些不具有同时降解DBP和DEHP的能力，这进一步表明DEHP比DBP更难降解，这一结果与DEHP更复杂的支链结构有关。鉴于DEHP更难降解，如果微生物能有效降解DEGHP，那么它们更容易降解结构相似、结构不复杂的DBP。系统发育多样性分析表明，已报道的PAEs降解菌存在于多个优势属中，它们之间没有明显的进化关系。这一结论与已报道的研究结论一致，即PAEs降解菌在自然环境中具有较高的遗传多样性。以上结果表明，污水处理污泥中存在多种类型的PAEs降解菌。高浓度DBP和DEHP的存在促使具有DBP/DEHP降解能力的微生物群落不断生长，进而成为优势微生物，最终实现DBP和DEHP的有效降解。然而，低浓度邻苯二甲酸酯的污染仍然会引起各种遗传损伤。因此，复杂环境中低浓度邻苯二甲酸酯的去除仍然是一个亟待解决的重要问题。
三。结论
(1)经过10天的培养，1000mg/L废水处理污泥的DBP和DEHP降解率分别可达99.9%和83.6%。DEHP的降解速率低于DBP的降解速率。
(DBP和DEHP的加入显著降低了污水处理污泥的微生物多样性。DBP和DEHP类群的物种组成相似，但与RS类群有所不同。
(3)污水处理污泥中PAEs降解菌种类繁多。高浓度DBP和DEHP的存在促使具有DBP/DEHP降解能力的微生物群落不断生长，进而成为优势微生物，最终实现DBP和DEHP的有效降解。(来源:浙江科技学院环境与资源学院、浙江省废弃物生物质资源化与生态处理技术重点实验室；浙江工商大学食品与生物工程学院)
免责声明：本网站内容来源网络，转载是出于传递更多信息之目的，并不意味赞成其观点或证实其内容真实性。转载稿涉及版权等问题，请立即联系网站编辑，我们会予以更改或删除相关文章，保证您的权利。
标签: 废水处理污泥中邻苯二甲酸酯降解菌的多样性